1535 wird auf großen Druck des Landesherren die Reformation an der Universität Tübingen eingeführt. Tübingen wird Hochburg der lutherischen Universitäts-Orthodoxie.
1536 wird das evangelische Stift als herzögliches Stipendium für den württembergischen Pfarrernachwuchs gegründet. Freiplätze ermöglichen auch hier, dass einige Minderbemittelte studieren können. 1549 stellt man die Alte Aula als Ersatz für das 1534 abgebrannte Hauptgebäude fertig. Der Brand vernichtete auch einen großen Teil der Bibliothek und die ältesten Verwaltungsakten.
Im 16. Jahrhundert, in den Zeiten des "schwarzen Tods" weicht die Uni mehrmals in andere Städte wie Calw, Esslingen oder Altensteig aus. Der Universitätsbetrieb wird die ganze Zeit über aufrechterhalten. So studiert z.B. Johannes Keppler von 1589 bis 1594 im Tübinger Stift. 1594 wird das Kollegium Illustre als Ritterakademie für den protestantischen Adel mit modernen Unterrichtsfächern wie neue Sprachen und körperlichen Übungen eröffnet. 1601 verstärkt Herzog Friedrich von Württemberg mit neuen Statuten die über 150 Jahre Bestand haben, die landesherrliche Aufsicht über die Universität.
Ab 1634 erfolgt ein starker Niedergang der Universität durch den Dreißigjährigen Krieg. Allein 1635 stirbt die Hälfte des Lehrkörpers an der Pest. 1688 Nach nicht einmal 100 Jahren macht das Kollegium Illustre die Pforten wieder dicht.
1752 wird das Tübinger Schloss erstmals von der Universität genutzt. Eine Sternwarte wird eingebaut. 1769 gibt Herzog Karl Eugen von Württemberg der Uni durch Hinzufügen seines Namens die heutige Bezeichnung ‚Eberhardina Carolina'. Hölderlin, Hegel und Schelling studieren gleichzeitig im Stift.
1805 Öffnet die erste Uniklinik im Gebäude der alten Burse. Hölderlin ist hier einer der ersten Psychiatrie-Patienten. Ab 1806 rauben mehrere Verfassungsreformen (Organische Gesetze) der Universität ihre Autonomie und die Uni wird staatliche Bildungsanstalt. 1816 wird das Schloss Hohentübingen der Uni komplett überlassen. Im gleichen Jahr kommt es zur Gründung der ersten Tübinger Burschenschaft namens Arminia. 1817 wird die Universität um zwei neue Fakultäten erweitert: um die 1812 als Friedrichs-Universität in Ellwangen gegründete kath. - theolog. Fakultät und die staatswirtschaftliche Fakultät. Bei der staatswirtschaftlichen Fakultät handelt es sich um die älteste noch existierende Fakultät ihrer Art in Deutschland. Friedrich List lehrte hier als Professor (1817 - 1819). Im Gebäude des Kollegium Illustre wird ein Konvikt für kath. Theologiestudenten errichtet. 1818 löst das Attentat des ehemaligen Tübinger Studenten Sand auf Kotzebue die Karlsbader Beschlüsse aus. Mit ihnen beginnt eine Zeit der staatlichen Überwachung der Universitäten. Im Zuge dieser Überwachung werden auch die ersten Burschenschaften verboten. Die Zeit der Demagogenverfolgung bricht an. 1821, inmitten der Ära Metternich (Wiener Kongress), erhält Tübingen mit Zustimmung des Königs einen ‚Ausschuss der Studierenden'. Während der verschärften Demagogenverfolgung wird dieser Ausschuss aber 1825 wieder abgeschafft.
1828 werden die Universitätsfinanzen neu geordnet: In den staatlichen Haushaltsplan wird ein regelmäßiger Zuschuss für die Universität eingestellt, er beträgt zunächst 80 000 Gulden und steigt im Laufe der Zeit bis heute auf nahezu 300 Millionen Euro an.
1845 wird die Neue Aula eingeweiht. In den folgenden Jahrzehnten findet eine planmäßige Erweiterung der Universität, insbesondere der Kliniken, zu einem neuen Stadtviertel statt. 1863 wird die erste naturwissenschaftliche Fakultät an einer deutschen Universität durch Zusammenfassung der bisher auf die Medizinische und die Philosophische Fakultät aufgeteilten naturwissenschaftlichen Fächer gegründet. Es folgt ein schwunghafter Aufstieg der Uni. 1876 zählt Tübingen erstmals mehr als 1000 Studenten. 1904 lässt Tübingen auf Druck des württembergischen Ministeriums des Kirchen- und Schulwesens als sechste Uni im Deutschen Reich Frauen zum Studium zu. Vorausgegangen waren die Länder Baden und Bayern. 1918 wird der Allgemeine Studentenausschuß -AStA-, in seiner heute noch bestehenden Form, gegründet. 1919 wird dann die Tübinger Studentenhilfe gegründet, sie ist heute unter dem Namen Studentenwerk bekannt.
1927 feiert die Universität ihr 450. Jubiläum. Eberhardina ist dabei und darf die Universitätsfahne tragen. Ab 1933 erfolgt die Gleichschaltung der Universitäten durch die Nazis. Der Universitätskanzler muss sein Amt niederlegen. Im WS 33/34 gehören 62% des Lehrkörpers der NSdAP an. 1936 kommt es zur Zwangsauflösung der Korporationen. Eine Folge des Nationalsozialismus und des beginnenden Krieges ist der starke Rückgang der Studentenzahlen. Der Tiefstand ist 1940 mit 889 Studenten erreicht. 1942 verliert die Universität ihre Rechtsfähigkeit. Das seit der Gründung angesammelten Vermögen, wird an den württembergischen Fiskus übereignet. 1945 schließt die Universität bis Kriegsende. Nach der Aufnahme des Lehrbetriebes in den beiden theolog. Fakultäten erfolgt am 15. Okt.1945 die feierliche Wiedereröffnung der Universität. Die ehemaligen NSdAP Mitglieder werden entlassen. Eine zeitweilige Aufnahmesperre für Frauen zugunsten von Kriegsteilnehmern wird erlassen. Nach dem Krieg beginnt ein rapides Ansteigen der Studentenzahlen. 1952 verliert die Universität Tübingen durch Bildung des Landes Baden-Württemberg den de-facto Status einer württembergischen Landesuniversität. 1958 wir die Erweiterung der Universität in Richtung Norden - Schnarrenberg, Morgenstelle und Rosenau -beschlossen. Nach dem Anwachsen zu einer Massenuniversität führt die Universität Tübingen 1961 den 1953 aufgehobenen Numerus Clausus wieder ein, zuerst in den Studiengängen Medizin und Zahnmedizin, später auch für alle anderen Studiengänge. 1974 werden nach zehnjähriger Bauzeit die ersten naturwissenschaftlichen Institute auf der Morgenstelle bezogen. 1977 feiert die Universität ihr 500. Jubiläum in Gegenwart des Bundespräsidenten in einem großen Festakt. Die Alte Turnerschaft Eberhardina-Markomannia ist auch mit dabei.
1978 zählt die Universität über 20000 Studierende, darunter erstmals mehr als 1000 aus anderen Ländern als Deutschland. 1993 ist ein neuer Höchststand mit 26.245 Studierenden erreicht, der Anteil der Studentinnen beträgt 45,6%. 1998 studieren dann erstmals mehr Studentinnen als Studenten an der Universität Tübingen. Die Studentenzahlen sinken wieder unter 20000 Studierende.